• 中国科技论文统计源期刊
  • 中国科技核心期刊
  • 中国高校优秀期刊
  • 安徽省优秀科技期刊

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

应用CRISPR/Cas9技术敲除Trib3基因大鼠的基因型鉴定

蔡昊 桂峥 杨铮 李妍 刘娜 霍哈日汗 卜凡一 邹振雨 段雅干 刘陶迪

引用本文:
Citation:

应用CRISPR/Cas9技术敲除Trib3基因大鼠的基因型鉴定

    作者简介: 蔡昊(1994-), 男,蒙古族,硕士
    通讯作者: 刘陶迪, taodiliu@163.com
  • 基金项目:

    内蒙古医科大学2019年博士启动基金 YKD2019BSJJ009

    内蒙古自然科学基金项目 2018MS03008

  • 中图分类号: Q492.4

Genotype identification of Trib3 knockout rats using CRISPR/Cas9 technology

    Corresponding author: LIU Tao-di, taodiliu@163.com
  • CLC number: Q492.4

  • 摘要: 目的构建Trib3基因敲除大鼠模型及基因型鉴定。方法靶向敲除大鼠Trib3基因后,通过基因测序和PCR技术对大鼠Trib3基因的第3号外显子删除情况进行检测与基因型鉴定。结果得到阳性F0代首建大鼠Trib3-/+,通过自交得到F1与F2代大鼠,筛选出F2代Trib3-/-大鼠。结论成功制备Trib3基因敲除大鼠模型,依次鉴定出Trib3-/-、Trib3-/+和Trib3+/+大鼠,并可以稳定遗传,为后续的实验开展提供理论依据。
  • 图 1  大鼠Trib3基因敲除片段

    图 2  F0代大鼠电泳图(WT为野生型大鼠Trib3+/+; 图中数字为大鼠编号后最后两位,前两位87未标出,如: 34代表8734)

    图 3  8734、8735、8737三只阳性样品送测序鉴定序列(图中4个箭头分别显示8734、8735、8737和904 1四只founder鼠的序列比对结果, 其中空心部分为删除的序列,实心部分剩余序列。经序列分析, 8734、8735和8737三只阳性founder大鼠样品均完全删除)

    图 4  F1代10156~10171电泳图(图中数字为大鼠编号后最后两位,前三位101未标出,如: 57代表10157)

    图 5  F1代10172~10181电泳图(N: 野生型大鼠Trib3+/+, B: 空白组; 图中数字为大鼠编号后最后两位,前三位101未标出,如: 73代表10173)

    图 6  F1代1370~1380电泳图(图中数字为大鼠编号后最后两位, 前两位13未标出,如: 71代表1371)

    图 7  引物鉴定模式图

    图 8  F2代大鼠Trib3基因的琼脂糖凝胶电泳图

    图 9  F2代大鼠Trib3基因的琼脂糖凝胶电泳图

    表 1  寡核苷酸引物列表

    引物 序列(5′~3′)
    Trib3-seq-F1 GCT CCC TTC TAA AAT AAC AAC CCA C
    Trib3-seq-F2 GTA TAC CTG TGC TTA GCA TGT GGA AG
    Trib3-seq-R TTT GTC AGA TAC CTT GGA CTT GGA G
    下载: 导出CSV

    表 2  F0代基因敲除大鼠出生情况

    编号 性别 出生日期 Trib3敲除情况 是否淘汰
    8733 2019/4/12 未敲除
    8734 2019/4/12 已敲除
    8735 2019/4/12 已敲除
    8736 2019/4/12 未敲除
    8737 2019/4/12 已敲除
    8738 2019/4/12 未敲除
    8739 2019/4/12 未敲除
    8740 2019/4/12 未敲除
    8741 2019/4/12 未敲除
    8742 2019/4/12 未敲除
    8446 2019/4/16 未敲除
    9041 2019/4/26 已敲除
    下载: 导出CSV

    表 3  F1代基因敲除大鼠出生情况

    编号 性别 出生日期 基因型 亲代 是否淘汰
    10156 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
    10157 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
    10158 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
    10159 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
    10160 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
    10161 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
    10162 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
    10163 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
    10164 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
    10165 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
    10166 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
    10167 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10168 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10169 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10170 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10171 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10172 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂
    10173 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10174 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂
    10175 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂
    10176 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10177 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10178 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10179 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10180 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
    10181 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂
    1370 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1371 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1372 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1373 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1374 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1375 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1376 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1377 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1378 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1379 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    1380 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
    下载: 导出CSV

    表 4  基因型判断标准

    Trib3-seq-F1+Trib3-seq-R Trib3-seq-F2+Trib3-seq-R
    Trib3+/+ 1 498 bp 523 bp
    Trib3-/+ 333 bp 523 bp
    Trib3-/- 333 bp no product
    下载: 导出CSV

    表 5  F2代基因敲除大鼠出生情况

    编号 性别 出生日期 基因型 是否淘汰
    1 2019/9/25 杂合
    2 2019/9/25 杂合
    3 2019/9/25 杂合
    4 2019/9/25 野生
    5 2019/9/25 纯合
    6 2019/9/25 杂合
    7 2019/10/13 野生
    8 2019/10/13 杂合
    9 2019/10/13 纯合
    10 2019/10/13 纯合
    11 2019/10/13 纯合
    12 2019/10/13 纯合
    13 2019/10/13 杂合
    下载: 导出CSV
  • [1] ZHANG F, WEN Y, GUO X. CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges[J]. Hum Mol Genet, 2014, 23(R1): R40.
    [2] MA Y, ZHANG L, HUANG X. Genome modification by CRISPR/Cas9[J]. FEBS J, 2014, 281(23): 5186. doi: 10.1111/febs.13110
    [3] GUPTA D, BHATTACHARJEE O, MANDAL D, et al. 2019, CRISPR-Cas9 system: a new-fangled dawn in gene editing[J]. Life Sci, 232: 116636. doi: 10.1016/j.lfs.2019.116636
    [4] EYERS PA, KEESHAN K, KANNAN N. Tribbles in the 21st century: The evolving roles of tribbles pseudokinases in biology and disease[J]. Trends Cell Biol, 2017, 27(4): 284. doi: 10.1016/j.tcb.2016.11.002
    [5] YOKOYAMA T, NAKAMURA T. Tribbles in disease: signaling pathways important for cellular function and neoplastic transformation[J]. Cancer Sci, 2011, 102(6): 1115. doi: 10.1111/j.1349-7006.2011.01914.x
    [6] DU K, HERZIG S, KULKARNI RN, et al. TRB3: a tribbles homolog that inhibits Akt/PKB activation by insulin in liver[J]. Science, 2003, 300(5625): 1574. doi: 10.1126/science.1079817
    [7] HUA F, HU ZW. TRIB3-P62 interaction, diabetes and autophagy[J]. Oncotarget, 2015, 6(33): 34061. doi: 10.18632/oncotarget.6108
    [8] PRUDENTE S, BAILETTI D, MENDONCA C, et al. Infrequent TRIB3 coding variants and coronary artery disease in type 2 diabetes[J]. Atherosclerosis, 2015, 242(1): 334. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2015.07.030
    [9] XU J, LV S, QIN Y, et al. TRB3 interacts with CtIP and is overexpressed in certain cancers[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1770(2): 273. doi: 10.1016/j.bbagen.2006.09.025
    [10] HUA F, SHANG S, YANG YW. TRIB3 interacts with β-Catenin and TCF4 to increase stem cell features of colorectal cancer stem cells and tumorigenesis[J]. Gastroenterology, 2019, 156(3): 708. doi: 10.1053/j.gastro.2018.10.031
    [11] ZHANG X, ZHONG N, LI X, et al. TRIB3 promotes lung cancer progression by activating β-catenin signaling[J]. Eur J Pharmacol, 2019, 863: 172697. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172697
    [12] HONG B, ZHOU J, MA K, et al. TRIB3 promotes the proliferation and invasion of renal cell carcinoma cells via activating MAPK signaling pathway[J]. Int J Biol Sci, 2019, 15(3): 587. doi: 10.7150/ijbs.29737
    [13] QU J, LIU B, LI B, et al. TRIB3 suppresses proliferation and invasion and promotes apoptosis of endometrial cancer cells by regulating the AKT signaling pathway[J]. Onco Targets Ther, 2019, 12: 2235. doi: 10.2147/OTT.S189001
    [14] ZHANG C, HONG FF, WANG CC, et al. TRIB3 inhibits proliferation and promotes osteogenesis in hBMSCs by regulating the ERK1/2 signaling pathway[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 10342. doi: 10.1038/s41598-017-10601-w
    [15] 刘陶迪. 大鼠青春期前期精原干细胞自我更新和分化相关基因表达的初步研究[D]. 呼和浩特: 内蒙古大学, 2012.
    [16] AIMÉ P, SUN X, ZAREEN N, et al. Trib3 is elevated in Parkinson′s Disease and mediates death in parkinson′s disease Models[J]. J Neurosci, 2015, 35(30): 10731. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0614-15.2015
    [17] ZHAO Y, HAN Y, BU DF, et al. Reduced AKT phosphorylation contributes to endoplasmic reticulum stress-mediated hippocampal neuronal apoptosis in rat recurrent febrile seizure[J]. Life Sci, 2016, 153: 153. doi: 10.1016/j.lfs.2016.04.008
    [18] ZHANG J, HAN Y, ZHAO Y, et al. Inhibition of TRIB3 protects against neurotoxic injury induced by kainic acid in rats[J]. Front Pharmacol, 2019, 10: 585. doi: 10.3389/fphar.2019.00585
    [19] SOWERS JR. Role of TRIB3 in diabetic and overnutrition-induced atherosclerosis[J]. Diabetes, 2012, 61(2): 265. doi: 10.2337/db11-1495
    [20] WANG S, WANG C, LI X, et al. Down-regulation of TRIB3 inhibits the progression of ovarian cancer via MEK/ERK signaling pathway[J]. Cancer Cell Int, 2020, 20: 418. doi: 10.1186/s12935-020-01509-z
  • [1] 董春玲王桂芳肖奎李波马忠森白春学 . 水通道蛋白3基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定. 蚌埠医学院学报, 2007, 32(5): 505-507.
    [2] 陈传好韩卉陈昌杰 . 大鼠失神经支配表情肌NT-3基因转染的实验研究. 蚌埠医学院学报, 2004, 29(2): 104-105.
    [3] 孙志兵杨娟 . 慢病毒介导沉默SOCS3基因对糖尿病大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2020, 45(5): 572-577. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.05.004
    [4] 程玉芳陶静马善峰关宿东 . 大豆异黄酮对糖尿病大鼠心肌钙调控蛋白基因表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(6): 548-551.
    [5] 石建华范艳萍项平苗艳君胡小磊黄詠齐 . 糖皮质激素对普通大鼠和肥胖大鼠下丘脑AGRP、CART基因表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(6): 631-634.
    [6] 于影胡杰关宿东 . 阿霉素中毒大鼠肺组织中β-防御素-2的基因表达. 蚌埠医学院学报, 2009, 34(5): 376-378.
    [7] 胡建国王凤超钟政荣陆佩华 . 大鼠GAP-43基因的克隆及其在COS-7细胞的表达. 蚌埠医学院学报, 2007, 32(3): 253-255.
    [8] 于影胡杰高琴汪思应 . 大鼠肾下腹主动脉缺血再灌注对心肌肌浆网钙泵活性及其基因表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(2): 112-114.
    [9] 王刚曾洁盛呈雨任汝静周海燕陆国强丁健青陈生弟 . 大鼠野生型钾通道亚基Kir2.3基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(3): 253-255.
    [10] 侯晞梁枫李爱剑王灿戴体俊桂常青 . 银杏叶提取物联合依达拉奉对气虚血瘀型脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织NO及NOS表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(7): 673-676.
    [11] 孙美群陈前芬汪洪涛 . 新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(1): 19-21.
    [12] 周礼华徐淑秀江城梅 . 新生大鼠小脑颗粒神经元原代培养与鉴定. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(2): 121-123.
    [13] 项平黄锦桃撒亚莲刘爱军李海标 . 大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定. 蚌埠医学院学报, 2005, 30(1): 1-3.
    [14] 周忍冬 . 吡格列酮对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗和胰岛功能的影响. 蚌埠医学院学报, 2018, 43(2): 156-159. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2018.02.005
    [15] 王坤张少军 . Ⅳ型胶原酶尾壳核内注射致中重度脑出血大鼠模型的建立. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(4): 339-341.
    [16] 余刚何先弟 . ω-3多不饱和脂肪酸对脓毒血症急性肺损伤大鼠肺组织中核因子κB表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(4): 329-331.
    [17] 解为慈 . 萆苓祛痛方对糖尿病痛风模型大鼠肾脏HMGB1及FOXO3的影响. 蚌埠医学院学报, 2020, 45(2): 170-173. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.02.009
    [18] 吴道爱时照明杨青青吴晨辰丁言稳马博 . 双歧杆菌对2型糖尿病大鼠血浆酪酪肽和胰岛素抵抗的影响. 蚌埠医学院学报, 2019, 44(10): 1313-1315. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.10.005
    [19] 张远海 . 桃红四物汤对脑缺血再灌注损伤大鼠脑内血管新生及PI3K/AKT信号转导通路的影响. 蚌埠医学院学报, 2017, 42(1): 36-40,56. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2017.01.010
    [20] 徐丙发吴华璞祝晓光 . 姜黄素对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用. 蚌埠医学院学报, 2007, 32(6): 637-639,765.
  • 加载中
图(9)表(5)
计量
  • 文章访问数:  734
  • HTML全文浏览量:  307
  • PDF下载量:  2
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2021-06-10
  • 录用日期:  2021-09-11
  • 刊出日期:  2022-04-15

应用CRISPR/Cas9技术敲除Trib3基因大鼠的基因型鉴定

    通讯作者: 刘陶迪, taodiliu@163.com
    作者简介: 蔡昊(1994-), 男,蒙古族,硕士
  • 内蒙古医科大学 基础医学院, 内蒙古 呼和浩特 010000
基金项目:  内蒙古医科大学2019年博士启动基金 YKD2019BSJJ009内蒙古自然科学基金项目 2018MS03008

摘要: 目的构建Trib3基因敲除大鼠模型及基因型鉴定。方法靶向敲除大鼠Trib3基因后,通过基因测序和PCR技术对大鼠Trib3基因的第3号外显子删除情况进行检测与基因型鉴定。结果得到阳性F0代首建大鼠Trib3-/+,通过自交得到F1与F2代大鼠,筛选出F2代Trib3-/-大鼠。结论成功制备Trib3基因敲除大鼠模型,依次鉴定出Trib3-/-、Trib3-/+和Trib3+/+大鼠,并可以稳定遗传,为后续的实验开展提供理论依据。

English Abstract

  • 目前,CRISPR/Cas9技术是最强大的基因组编辑工具,由CRISPR RNA(crRNA)和Cas9核酸酶组成,DNA由Cas9引导并切割,导致靶位点双链断裂。在细胞DNA修复过程中,靶位点处发生目的基因片段插入、替换或删除[1]。CRISPR/Cas9有效地应用于基因敲除、内源性基因表达调控、活细胞标记染色体位点、编辑单链RNA和高通量基因筛选。CRISPR/Cas9技术的应用扩大了研究基因功能研究的样本种类,可以应用于发育机制、基因表达调控和动物行为等方面。同时,CRISPR/Cas9技术的应用有助于研究人员阐明靶基因功能,使研究特定基因功能成为可能[2-3]。因此,本研究应用CRISPR/Cas9技术高效构建Trib3基因敲除大鼠模型。

    Trib3基因位于人类染色体20p13-p12.2,包括4个外显子和3个内含子,TRIB3含有358个氨基酸残基[4]。Trib3基因是哺乳动物Tribbles家族的成员,Tribbles家族由Trib1、Trib2和Trib3三种基因组成[5]。目前有研究[6-8]表明Trib3在肝脏中被诱导表达,TRIB3通过直接与Akt结合,从而促进了Ⅱ型糖尿病易感性个体的胰岛素抵抗。另一项研究[9]表明TRIB3与细胞周期调节因子CtIP(Ctbp-interactions protein)相互作用,不仅破坏正常的细胞周期导致细胞癌变,还在癌细胞中过表达。TRIB3在结肠细胞中与β-catenin和TCF4相互作用,增加肿瘤干细胞相关基因的表达,敲除Trib3基因后可有效减少小鼠结肠肿瘤细胞数量[10]。TRIB3在肺癌组织中的表达显著增加,并与肺癌病人的生存时间呈反比。同时,TRIB3亦在其他类型的肿瘤中诱导表达[11]。有研究[12]显示TRIB3的表达与HIF-1α的表达相关,HIF-1α作为一种重要的转录因子,参与调控血管生成、携氧蛋白和葡萄糖代谢酶等多种相关基因的表达,是肾细胞癌发生发展的关键因素。TRIB3通过抑制AKT信号通路从而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导子宫内膜癌细胞凋亡[13]。Trib3基因除了与癌症有关,该基因也可以促进成骨发育[14]。但是,Trib3基因在精子发生中的作用鲜有报道,刘陶迪[15]通过高通量基因芯片技术检测,结果发现Trib3基因在精子发生过程中的表达差异性有20.3倍之多。因此,建立Trib3基因敲除大鼠模型来研究该基因在精子发生中功能具有重要意义。本研究中对基因敲除大鼠的基因型鉴定是Trib3基因功能研究的前期工作和重要环节,可为后续研究提供实验依据。

    • 基因敲除大鼠由北京维通达生物技术有限公司提供,品系为Wistar大鼠[许可证号: SCXK(京)2019-0002]。通过CRISPR/Cas9技术敲除大鼠Trib3基因。Trib3基因敲除大鼠饲养在内蒙古医科大学实验动物中心SPF级鼠房饲养和繁殖。

    • 血液组织DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit, 天根生化有限公司);PGK1.1 linear vector(南京大学南京生物医药研究院提供);2×San Taq PCRMix(Dye)(上海生工生物工程股份有限公司);invitrogen琼脂糖(美国Thermo Fisher Scientific);6×Loading buffer(武汉Biosharp生物技术有限公司);GoldView Ⅰ型核酸染色剂(北京Solarbio科技有限公司);D2000 DNA Marker[天根生化(北京)有限公司];超微量紫外分光光度仪(Thermo ND 2000L);PCR扩增仪(威泰克公司);水平电泳仪(北京柏奥易杰科技有限公司);凝胶成像系统(美国美国UVP公司)。

    • Trib3基因位于大鼠第3号染色体,Trib3基因编码蛋白的主要有1种剪接体:Trib3-201,编码349个氨基酸残基的蛋白,Trib3基因的3号外显子长度293 bp,非3的整数倍,删除后将造成后续编码区移码突变,导致Trib3基因功能丧失。因此本实验将Trib3基因的3号外显子删除。用大鼠Trib3基因特异sgRNA(single-guide RNA)介导Cas9核酸酶切割DNA出现特定的DSBs(Double-Stranded Breaks),在剪接体Trib3-201的3号外显子的上游及下游切口,通过NHEJ(Non-homologous end Joining)修复途径,将2个切口直接连接,同时删除两个切口之间的序列(即3号外显子)。用CRISPR Design设计筛选得到2个gRNA,分别是Trib3-gRNA1为5′-TGA GTC TAG TCA GCG GAG CAG GG-3′;Trib3-gRNA3为5′-ACT AAA GGA ATA GCT GCG GGT GG-3′。将纯化好的sgRNA、Cas9-mRNA共同注射到Wistar大鼠胚胎中,注射后将胚胎移植到代孕受体大鼠的输卵管内,胚胎移植后3~4周大鼠出生,出生2周左右完成基因型鉴定。

    • 对出生后8~10 d的大鼠进行剪脚趾标记编号。剪取8~10日龄大鼠脚趾,装入0.2 mL PCR管。加入200 μL缓冲液GA,用眼科剪剪碎,注射器抽打10次。加入20 μL Proteinase K溶液,混匀。56 ℃水浴过夜,直至组织溶解后。动物组织DNA提取参考总DNA试剂盒(TIANGEN, DP304)说明书进行操作,以ddH2O作为阴性对照品,使用超微量紫外分光光度仪(Thermo ND 2000L)测定DNA浓度(Conc)及DNA纯度,A260/A280比值在1.8左右为DNA纯度合格,浓度结果在100~300 ng/μL。

    • 引物由北京维通达生物技术有限公司设计、合成,引物序列见表 1。PCR反应条件为94 ℃ 4 min,94 ℃ 20 s,62 ℃ 25 s,72 ℃ 40 s,38个循环,72 ℃ 2 min结束。

      引物 序列(5′~3′)
      Trib3-seq-F1 GCT CCC TTC TAA AAT AAC AAC CCA C
      Trib3-seq-F2 GTA TAC CTG TGC TTA GCA TGT GGA AG
      Trib3-seq-R TTT GTC AGA TAC CTT GGA CTT GGA G

      表 1  寡核苷酸引物列表

    • 电泳条件:PCR扩增产物15 μL,6×Loading buffer 1.0 μL,1.3%琼脂糖凝胶,100 V恒压50 min,使用凝胶成像系统(美国美国UVP公司)拍照。

    • 应用CRISPR/Cas9敲除大鼠Trib3基因,Trib3基因的3号外显子长度293 bp,非3的整数倍,删除后将造成后续编码区移码突变,从而导致Trib3基因功能丧失(见图 1)。获得F0代大鼠(见表 2),对F0代founder大鼠敲除及鉴定见图 1~3。大鼠编号分别为8734♀、8735♀、8737♂、9041♂,4只F0代founder大鼠为基因敲除大鼠,其中9041♂founder大鼠死亡,最终获得1雄2雌共3只F0代founder大鼠,分别为8734♀、8735♀、8737♂。

      图  1  大鼠Trib3基因敲除片段

      编号 性别 出生日期 Trib3敲除情况 是否淘汰
      8733 2019/4/12 未敲除
      8734 2019/4/12 已敲除
      8735 2019/4/12 已敲除
      8736 2019/4/12 未敲除
      8737 2019/4/12 已敲除
      8738 2019/4/12 未敲除
      8739 2019/4/12 未敲除
      8740 2019/4/12 未敲除
      8741 2019/4/12 未敲除
      8742 2019/4/12 未敲除
      8446 2019/4/16 未敲除
      9041 2019/4/26 已敲除

      表 2  F0代基因敲除大鼠出生情况

      图  2  F0代大鼠电泳图(WT为野生型大鼠Trib3+/+; 图中数字为大鼠编号后最后两位,前两位87未标出,如: 34代表8734)

      图  3  8734、8735、8737三只阳性样品送测序鉴定序列(图中4个箭头分别显示8734、8735、8737和904 1四只founder鼠的序列比对结果, 其中空心部分为删除的序列,实心部分剩余序列。经序列分析, 8734、8735和8737三只阳性founder大鼠样品均完全删除)

    • 大鼠的性成熟期约为8周,母鼠妊娠期约为21 d,采用8734♀×8737♂、8735♀×wistar♂进行繁殖,获得F1代大鼠(见表 3),对出生的F1代大鼠进行鉴定(见图 4~6)。F1代大鼠10156~10166是8734♀×8737♂所生;F1代大鼠10167~10181是8734♀×8737♂所生,对F1代样品进行测序,将删除序列相同的大鼠归为一组(line),分为3个line,lineA:10156、10157、10159、10160、10164、10166来源于8734♀×8737♂,经测序,删除序列与founder鼠8734完全相同;lineB:10167、10169、10170、10179、10180来源于8735♀×wistar♂,经测序,删除序列与founder鼠8735完全相同;lineC:10168、10171、10177、10178来源于8735♀×wistar♂,经测序,删除序列与founder鼠不同。

      编号 性别 出生日期 基因型 亲代 是否淘汰
      10156 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
      10157 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
      10158 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
      10159 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
      10160 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
      10161 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
      10162 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
      10163 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
      10164 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
      10165 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂
      10166 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂
      10167 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10168 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10169 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10170 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10171 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10172 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂
      10173 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10174 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂
      10175 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂
      10176 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10177 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10178 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10179 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10180 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂
      10181 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂
      1370 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1371 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1372 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1373 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1374 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1375 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1376 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1377 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1378 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1379 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂
      1380 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂

      表 3  F1代基因敲除大鼠出生情况

      图  4  F1代10156~10171电泳图(图中数字为大鼠编号后最后两位,前三位101未标出,如: 57代表10157)

      图  5  F1代10172~10181电泳图(N: 野生型大鼠Trib3+/+, B: 空白组; 图中数字为大鼠编号后最后两位,前三位101未标出,如: 73代表10173)

      图  6  F1代1370~1380电泳图(图中数字为大鼠编号后最后两位, 前两位13未标出,如: 71代表1371)

    • 经CRISPR/Cas9敲除Trib3基因相应位点后导致其突变,基因型判断标准(见表 4):KO引物Trib3-seq-F1的PCR产物长度为333 bp,WT引物Trib3-seq-F2的PCR产物将消失的为纯合子大鼠(Trib3-/-);KO引物Trib3-seq-F1扩增产物长度为1 498 bp,WT引物Trib3-seq-F2的PCR产物长度为523为野生型大鼠(Trib3+/+);KO引物Trib3-seq-F1扩增产物长度为333 bp,并且WT引物Trib3-seq-F2的PCR产物长度为523为杂合型大鼠(Trib3-/+)。F2代大鼠1~6是10166♂× 10159♀所生;F2代大鼠7~13是10179♂×10167♀所生(见表 5)。鉴定结果结果:F2代中5号、9号、10号、11号、12号大鼠为纯合型大鼠(见图 7~9)。

      Trib3-seq-F1+Trib3-seq-R Trib3-seq-F2+Trib3-seq-R
      Trib3+/+ 1 498 bp 523 bp
      Trib3-/+ 333 bp 523 bp
      Trib3-/- 333 bp no product

      表 4  基因型判断标准

      编号 性别 出生日期 基因型 是否淘汰
      1 2019/9/25 杂合
      2 2019/9/25 杂合
      3 2019/9/25 杂合
      4 2019/9/25 野生
      5 2019/9/25 纯合
      6 2019/9/25 杂合
      7 2019/10/13 野生
      8 2019/10/13 杂合
      9 2019/10/13 纯合
      10 2019/10/13 纯合
      11 2019/10/13 纯合
      12 2019/10/13 纯合
      13 2019/10/13 杂合

      表 5  F2代基因敲除大鼠出生情况

      图  7  引物鉴定模式图

      图  8  F2代大鼠Trib3基因的琼脂糖凝胶电泳图

      图  9  F2代大鼠Trib3基因的琼脂糖凝胶电泳图

    • Trib3基因可能与很多疾病相关,例如该基因过表达可促进神经元死亡,沉默TRIB3可抑制神经元PC12细胞的死亡[16]。TRIB3沉默促进缺氧缺血后的海马神经元增殖、抑制细胞凋亡[17],TRIB3介导的抑制AKT促进大鼠海马神经元凋亡,从而诱发癫痫发作[18]。此外,沉默TRIB3可能为减轻动脉粥样硬化疾病提供一种新的治疗方向[19]。TRIB3在卵巢癌组织中过表达和卵巢癌预后不良有关,TRIB3可能通过激活MEK/ERK信号通路促进卵巢癌的恶性行为[20]。Trib3表达上调可能会促进BMP2诱导骨形成,因此Trib3在成骨形成过程中起重要作用。

      传统的动物模型受到物种、环境、时间等诸多因素的影响,基因敲除动物模型的建立为研究人类基因提供崭新的方法。目前,CRISPR/Cas9技术已经相对成熟, 能够精确修饰基因组。人们可以对一些结构极其复杂的细胞基因组进行定点、定量的改变,从而达到研究目的,简言之,就是定向地改变实验对象的遗传结构和特征。被改造过的基因是可以随染色体DNA复制而稳定遗传,而且所表达出来的性状是可以稳定遗传的。基因敲除模型的建立在基因功能的研究与临床医疗的应用中具有重要意义。目前,Trib3基因与生殖相关方面的内容以及Trib3基因敲除大鼠模型的建立鲜有报道,因此,Trib3基因敲除大鼠模型有利于探究Trib3在生殖过程中的作用,对其他致病机制的研究及治疗药物的筛选具有重要意义。

      本研究利用CRISPR/Cas9技术定向敲除wistar大鼠Trib3基因第3外显子,大鼠Trib3基因特异sgRNA(single-guide RNA)介导Cas9核酸酶切割DNA出现特定的DSBs(Double-Stranded Breaks),在剪接体Trib3-201的3号外显子的上游及下游切口,通过NHEJ(Non-homologous end Joining)修复途径将2个切口直接连接,同时删除两个切口之间的序列(即3号外显子)。Trib3基因的3号外显子长度293 bp,非3的整数倍,删除后将造成后续编码区移码突变,导致Trib3基因功能丧失。本研究首次建立纯合型Trib3-/-大鼠模型。观察发现Trib3基因敲除大鼠不具有胚胎致死性,敲除Trib3基因大鼠仍具有生育能力。该研究成功建立稳定遗传的Trib3基因敲除大鼠模型并为探究Trib3基因功能提供理想的动物模型。接下来的工作我们将检测精子发生中的标记性基因表达水平,探究Trib3基因对雄性大鼠生殖表型的影响,同时监测激素水平的变化,建立体外大鼠睾丸组织细胞共培养体系,寻找该基因与精子发生相关的上下游信号通路,构建完善的基因研究框架,进一步阐明该基因在精子发生中的作用,为探究该基因与男性不育的相关关系奠定基础。因此获得稳定遗传的Trib3基因敲除大鼠是后续实验的前提条件,基因敲除大鼠的基因型鉴定是后续工作的首要环节和关键步骤,同时,是保证实验数据可靠性的必要条件。

参考文献 (20)

目录

    /

    返回文章
    返回