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维生素C预处理对脓毒症小鼠肺组织miR126a-5p、miR155-5p表达的影响

王娇 邹琪 刘成 楚新旭 汪华学

引用本文:
Citation:

维生素C预处理对脓毒症小鼠肺组织miR126a-5p、miR155-5p表达的影响

    作者简介: 王娇(1990-),女,硕士研究生
    通讯作者: 汪华学, huaxuew2010@163.com
  • 基金项目:

    安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2019A0351

    安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2018A0244

  • 中图分类号: R459.7

Effect of vitamin C on the expression of miR126a-5p and miR155-5p in the lung tissue of sepsis mice

    Corresponding author: WANG Hua-xue, huaxuew2010@163.com
  • CLC number: R459.7

  • 摘要: 目的观察维生素C(vitamin C,Vit C)干预后脓毒症小鼠肺组织炎症表达情况及miR126a-5p和miR155-5p含量的变化,分析Vit C对脓毒症急性肺损伤的潜在保护机制。方法选择4~6周雄性小鼠18只随机分为假手术组(对照组、CON组)、脓毒症+NS组(SEP组)、脓毒症组+Vit C干预组(SEP+IR组),予Vit C 1 000 mg/kg术前连续3 d尾静脉进行注射,采用盲肠穿刺结扎制作模型,术后12 h检测肺组织的湿重/干重(W/D);用HE染色的方法观察肺脏病理形态,测量肺泡的直径;用RT-qPCR检测miR126a-5p、miR155-5p的变化,Western blotting检测Caspase 1及Caspase-3的蛋白表达量,ELISA法检测白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α表达。结果与CON组相比,SEP组中肺的W/D增加, 肺泡孔径明显减小;SEP组中的miR126a-5p和miR155-5p以及蛋白Caspase 1和Caspase 3表达量升高;同时可进一步促进炎症因子IL-6和TNF-α增加(P<0.05)。与SEP组相比,SEP+IR肺组织的W/D减低,肺泡孔径增大,miR126a-5p和miR155-5p以及蛋白Caspase 1和Caspase 3表达量降低,同时可进一步抑制炎症因子IL-6和TNF-α的增加(P<0.05)。结论Vit C具有减轻肺水肿和稳定肺泡体积的作用,可能与miR126a-5p和miR155-5p诱导的Caspase 1、Caspase 3表达降低有关。
  • 表 1  3组小鼠左肺质量比较(x±s)

    分组 n W/mg D/mg W/D
    Con组 6 77.9±2.0 19.0±2.0 4.10±0.4
    SEP组 6 142.2±1.0* 26.9±2.0 5.27±0.3*
    SEP+IR组 6 130.0±20* 25.0±10.0 5.23±0.2*
    F 51.84 2.83 27.45
    P < 0.01 >0.05 < 0.01
    MS组内 135.000 36.000 0.097
    q检验:与Con组比较*P<0.05
    下载: 导出CSV

    表 2  3组肺组织的肺泡孔径(x±s)

    分组 n 肺泡直径/μm F P MS组内
    Con组 6 60.800±8.000
    SEP组 6 13.146±3.000* 60.48 < 0.01 57.667
    SEP+IR组 6 30.592±10.000*#
    q检验:与Con组比较*P<0.05;与SEP组比较#P<0.05
    下载: 导出CSV

    表 3  3组肺组织miR155-5p、miR126a-5p的表达情况(x±s)

    分组 n miR155-5p相对表达量 miR126a-5p相对表达量
    Con组 6 1±0 1±0
    SEP组 6 6.500±0.500* 7.200±0.500*
    SEP+IR 6 1.190±0.050# 1.137±0.030#
    F 694.84 899.39
    P < 0.01 < 0.01
    MS组内 0.084 0.084
    q检验:与Con组比较*P<0.05;与SEP组比较#P<0.05
    下载: 导出CSV

    表 4  3组肺组织Caspase 1和Caspase 3蛋白的表达情况(x±s)

    分组 n Caspase 1/β-actin Caspase 3/β-actin
    Con组 6 0.840 0±0.001 1.3090±0.000 3
    SEP组 6 1.870 0±1.000* 1.991 0±0.000 4*
    SEP+IR组 6 1.269 0±0.090# 1.740 0±0.004 0*#
    F 4.78 131 794.34
    P < 0.05 < 0.01
    MS组内 0.336 0.000
    q检验:与Con组比较*P<0.05;与SEP组比较#P<0.05
    下载: 导出CSV

    表 5  3组肺组织的IL-6及TNF-α表达(x±s; ×105pg/μg)

    分组 n IL-6因子表达量 TNF-α因子表达量
    Con组 6 390±20 60±4
    SEP组 6 830±30* 120±2*
    SEP+IR组 6 740±50*# 100±4*#
    F 255.95 466.67
    P < 0.01 < 0.01
    MS组内 1 266.667 12.000
    q检验:与Con组比较*P<0.05;与SEP组比较#P<0.05
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-15
  • 录用日期:  2021-09-27
  • 刊出日期:  2022-04-15

维生素C预处理对脓毒症小鼠肺组织miR126a-5p、miR155-5p表达的影响

    通讯作者: 汪华学, huaxuew2010@163.com
    作者简介: 王娇(1990-),女,硕士研究生
  • 1. 蚌埠医学院第一附属医院 重症医学科,安徽 蚌埠 233004
  • 2. 蚌埠医学院 组织移植重点实验室,安徽 蚌埠 233030
基金项目:  安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2019A0351安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2018A0244

摘要: 目的观察维生素C(vitamin C,Vit C)干预后脓毒症小鼠肺组织炎症表达情况及miR126a-5p和miR155-5p含量的变化,分析Vit C对脓毒症急性肺损伤的潜在保护机制。方法选择4~6周雄性小鼠18只随机分为假手术组(对照组、CON组)、脓毒症+NS组(SEP组)、脓毒症组+Vit C干预组(SEP+IR组),予Vit C 1 000 mg/kg术前连续3 d尾静脉进行注射,采用盲肠穿刺结扎制作模型,术后12 h检测肺组织的湿重/干重(W/D);用HE染色的方法观察肺脏病理形态,测量肺泡的直径;用RT-qPCR检测miR126a-5p、miR155-5p的变化,Western blotting检测Caspase 1及Caspase-3的蛋白表达量,ELISA法检测白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α表达。结果与CON组相比,SEP组中肺的W/D增加, 肺泡孔径明显减小;SEP组中的miR126a-5p和miR155-5p以及蛋白Caspase 1和Caspase 3表达量升高;同时可进一步促进炎症因子IL-6和TNF-α增加(P<0.05)。与SEP组相比,SEP+IR肺组织的W/D减低,肺泡孔径增大,miR126a-5p和miR155-5p以及蛋白Caspase 1和Caspase 3表达量降低,同时可进一步抑制炎症因子IL-6和TNF-α的增加(P<0.05)。结论Vit C具有减轻肺水肿和稳定肺泡体积的作用,可能与miR126a-5p和miR155-5p诱导的Caspase 1、Caspase 3表达降低有关。

English Abstract

  • 脓毒症是指因感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍,病人常常需要入住重症医学科加强监护治疗,需要多种脏器支持措施,医疗耗费巨大,许多病人因缺乏有效救治而死亡[1-6]。在脓毒症综合治疗措施中,寻找经济实惠且具有确切治疗效果的药物成为临床追求的目标之一。已有的研究[6]表明静脉输注大剂量维生素C(Vit C)可以作为脓毒症的辅助治疗。Vit C作为一种常见的抗氧化剂,能清除氧自由基,刺激内皮细胞增殖,抑制凋亡,通过增加一氧化氮(NO)的生物利用度调节血流,具有一定程度的抗炎、抗氧化及增强免疫的作用[7]。相关研究[8]证实,补充Vit C可以预防、治疗呼吸道及全身感染。FISHER等通过雄性辛克莱猪的实验证明了Vit C对脓毒症具有抗炎作用,Vit C对脓毒症的抗炎作用机制与miRNA表达变化可能存在一定的关系[9-12];另有研究[13]显示Vit C没有显著改善脓毒症器官功能障碍评分和改善炎症和血管损伤标志物的作用。目前,Vit C对脓毒症的临床疗效尚不确切。应用Vit C后,脓毒症病人血浆miR126水平显著增高;而在脓毒症小鼠血浆miR155水平显著增高[11-12],其机制尚不完全清楚。本研究通过制作脓毒症小鼠模型,探讨Vit C对脓毒症肺脏组织的影响及其潜在的作用机制,为临床治疗脓毒症提供思路。

    • SPF级BALB-C小鼠(许可证号SCXK(鲁)20190003)18只,体质量(20±2)g,购自合肥蜀山公司。均饲养于蚌埠医学院实验动物中心,饲养温度20 ℃,光照12 h,自由饮食和喝水,饲养4~6周后进行研究。流程遵照蚌埠医学院伦理委员会指定的实验室动物使用和护理指南进行。将饲养4~6周的雄性小鼠随机分为对照(CON)组、脓毒症(SEP)组和干预(SEP+IR)组,每组6只。实验开始前3 d,SEP+IR组接受连续3 d静脉注射Vit C(1 000 mg/kg)[14],CON组和SEP组则接受连续3 d静脉注射等量0.9%氯化钠溶液。3 d后采用盲肠穿刺结扎法,制作SEP组和SEP+IR组脓毒症模型,CON组腹腔打开后未穿刺结扎直接缝合,分别留取肺组织标本保存12 h。

    • 取左肺使用预冷的PBS洗涤完全,用滤纸尽可能吸除多余水分,称量湿重(W)。用温箱在80 ℃条件下干燥48 h后称量干重(D),计算W/D;另取右肺洗涤后用4%组织固定液浸泡固定,经梯度乙醇脱水,环保型透明液进行透明,不同熔点蜡进行浸蜡和包埋,在光学显微镜下观察肺脏组织学变化情况,另留取相关标本-80 ℃冻存待测。

    • 在冰上研磨提取小鼠组织加入Trizol试剂,提取RNA,逆转录为cDNA,最后使用荧光定量PCR试剂盒进行检测,并用2-△△CT法计算miR126a-5p、miR155-5p相对表达量。反应条件为:预变性95 ℃10 min,变性95 ℃10 s,退火58 ℃20 s,延伸72 ℃10 s,引物miR126a-5p:F(5′-3′)CCG GGC GCA TTA TTA CTT TTG GTA CGC G,miR155-5p:F(5′-3′)CCG GGC GTT AAT GCT AAT TGT GAT AGG GGT。

    • 取各实验组小鼠约0.1 g肺组织匀浆提取上清液并加入RIPA和蛋白抑制剂,应用BCA试剂盒测蛋白质浓度,SDS-PAGE上取等量蛋白样品进行电泳,使用湿法进行转膜,用脱脂牛奶完成封闭,孵育一抗至第2天,加入二抗,曝光,以β-actin为内参,计算Caspas-1、Caspase 3及Caspase 1/β-actin及Caspase 3/β-actin蛋白表达的相对量。

    • 取冰冻肺组织解冻后应用ELISA试剂盒检测IL-6,TNF-α,取肺组织以1∶10的比例加入PBS进行匀浆,4 ℃12 000 r/min,离心20 min,收集上清液,严格按照说明书进行操作。

    • 采用方差分析及q检验。

    • 与CON组相比,SEP组W/D明显增加,肺泡孔径明显减小;与SEP组相比,SEP+IR组W/D降低,肺泡孔径增大(P<0.05)(见表 12)。

      分组 n W/mg D/mg W/D
      Con组 6 77.9±2.0 19.0±2.0 4.10±0.4
      SEP组 6 142.2±1.0* 26.9±2.0 5.27±0.3*
      SEP+IR组 6 130.0±20* 25.0±10.0 5.23±0.2*
      F 51.84 2.83 27.45
      P < 0.01 >0.05 < 0.01
      MS组内 135.000 36.000 0.097
      q检验:与Con组比较*P<0.05

      表 1  3组小鼠左肺质量比较(x±s)

      分组 n 肺泡直径/μm F P MS组内
      Con组 6 60.800±8.000
      SEP组 6 13.146±3.000* 60.48 < 0.01 57.667
      SEP+IR组 6 30.592±10.000*#
      q检验:与Con组比较*P<0.05;与SEP组比较#P<0.05

      表 2  3组肺组织的肺泡孔径(x±s)

    • 3组miR155-5p和miR126a-5p含量差异均有统计学意义(P<0.01);与SEP组相比,CON组和SEP+IR组miR155-5p和miR126a-5p含量均低,差异均有统计学意义(P<0.05)(见表 3)。

      分组 n miR155-5p相对表达量 miR126a-5p相对表达量
      Con组 6 1±0 1±0
      SEP组 6 6.500±0.500* 7.200±0.500*
      SEP+IR 6 1.190±0.050# 1.137±0.030#
      F 694.84 899.39
      P < 0.01 < 0.01
      MS组内 0.084 0.084
      q检验:与Con组比较*P<0.05;与SEP组比较#P<0.05

      表 3  3组肺组织miR155-5p、miR126a-5p的表达情况(x±s)

    • 3组Caspase 1、Caspase 3蛋白含量差异均有统计学意义(P<0.05~P<0.01);与CON组相比,SEP组、SEP+IR组Caspase 1、Caspase 3蛋白含量均升高;与SEP组相比,SEP+IR组Caspase 1、Caspase 3蛋白含量减低,差异均有统计学意义(P<0.05)(见表 4)。

      分组 n Caspase 1/β-actin Caspase 3/β-actin
      Con组 6 0.840 0±0.001 1.3090±0.000 3
      SEP组 6 1.870 0±1.000* 1.991 0±0.000 4*
      SEP+IR组 6 1.269 0±0.090# 1.740 0±0.004 0*#
      F 4.78 131 794.34
      P < 0.05 < 0.01
      MS组内 0.336 0.000
      q检验:与Con组比较*P<0.05;与SEP组比较#P<0.05

      表 4  3组肺组织Caspase 1和Caspase 3蛋白的表达情况(x±s)

    • 与CON组相比,SEP组和SEP+IR组肺组织IL-6、TNF-α含量均升高;与SEP组相比,SEP+IR组肺组织IL-6、TNF-α含量均减低,差异均有统计学意义(P<0.05)(见表 5)。

      分组 n IL-6因子表达量 TNF-α因子表达量
      Con组 6 390±20 60±4
      SEP组 6 830±30* 120±2*
      SEP+IR组 6 740±50*# 100±4*#
      F 255.95 466.67
      P < 0.01 < 0.01
      MS组内 1 266.667 12.000
      q检验:与Con组比较*P<0.05;与SEP组比较#P<0.05

      表 5  3组肺组织的IL-6及TNF-α表达(x±s; ×105pg/μg)

    • 脓毒症是感染导致的宿主体内平衡失调,内皮功能障碍和实质细胞失调引起的新陈代谢失衡而引起的危及生命的器官功能障碍,常常存在免疫失调和炎症因子风暴[15]。宿主对感染的失调反应,以及急性多器官结构功能障碍与脓毒症的高死亡率相关,其中呼吸、循环及免疫系统异常最为常见[16-17]。自2004年拯救脓毒症运动(SSC)发布了第一版指南以来,尽管脓毒症的治疗取得了很大进展,但病死率仍居高不下[18]。其核心问题在于关于脓毒症的炎症反应控制仍然是一个棘手问题。寻找恰当的控制炎症反应的药物是各国学者孜孜不倦的追求目标。众所周知,Vit C是重要的内源性抗氧化剂。已有病理研究证明,流感病人Vit C缺乏,肺部感染易恶化加重[19],提示Vit C有抑制炎症的作用。研究发现,Vit C具有抗炎作用并影响Caspase 3的表达,显著降低脓毒症相关心肌Caspase 3和Caspase-8的升高,增强巨噬细胞的摄取和清除,抑制坏死(包括网状病),提示其抗炎作用与caspase通路相关[8, 19-20]。本研究发现应用Vit C干预后,脓毒症小鼠肺组织异常结构得到改善,炎症异常活化受到抑制。而我们团队前期发现miR126在炎症过程中通过Caspase信号通路调控淋巴细胞凋亡[21]。脓毒症及miRNA与凋亡有一定的关系[22-24],这一点在本研究中亦有发现。与对照组相比,脓毒症组小鼠肺组织W/D比值增加,明显的肺泡萎陷及炎症细胞浸润,且脓毒症小鼠炎症因子IL-6和TNF-α表达明显升高。而在应用Vit C干预后,脓毒症小鼠肺组织结构异常和功能障碍得到改善,炎症异常激活受到抑制,表明Vit C具有稳定肺泡结构及抑制异常炎症活化作用。

      Caspase是介导细胞程序性死亡的重要媒介,其在诱导细胞特异性死亡的同时还具有活化炎症介质等多种功能。以Caspase 1为例,它是许多细胞对应激活炎症反应的中心,通过形成NLRP-ASC-Caspase炎症体复合物对病原体和内源性介质作出反应而被激活,诱导炎症介质IL-1β和IL-18裂解成活性形式[25]。Caspase 3是程序性细胞死亡的核心角色,负责灭活蛋白,保护活细胞免受凋亡。我们课题组前期发现miR126在炎症过程中通过Caspase信号通路调控淋巴细胞凋亡[21]; 本研究发现,脓毒症小鼠肺组织Caspase 1和Caspase 3表达明显升高,可能与Caspase 1和Caspase 3介导的炎症活化及细胞程序性死亡相关,但应用Vit C后有所改善。

      miRNAs作为一种内源性22 nt RNA,对机体多种重要生理功能发挥调控并在机体炎症功能中扮演重要角色。相关研究[26-27]证实,miR155的表达与炎症密切相关,脓毒症病人的miR155水平明显高于健康病人,并且与病人的炎症程度及预后成正相关。本研究同样观察到类似情况,与对照组相比,脓毒症组小鼠肺组Caspase 1、Caspase 3、miR126a-5p及miR155-5p表达均明显升高,提示miRNAs与炎症存在潜在性关系。此外,本研究还观察到应用Vit C干预后,脓毒症的炎症反应减轻的同时伴有miR126a-5p及miR155-5p表达的降低,提示Vit C抑制Caspase 1和Caspase 3表达的同时还通过干预miR126a-5p及miR155-5p的表达来改善炎症。

      本研究还观察到,应用Vit C干预脓毒症小鼠后,脓毒症肺损伤有不同程度减轻,同时伴有miR126a-5p和miR155-5p蛋白、Caspase 1和Caspase 3蛋白以及IL-6、TNF-α表达降低,表明Vit C可能通过miR126a-5p和miR155-5p表达降低Caspase 1和Caspase 3活性,从而降低小鼠肺组织中IL-6和TNF-α等促炎症细胞因子的分泌,减轻肺部炎症,起到肺保护作用。

      综上所述,本研究结果显示,脓毒症小鼠肺组织存在炎症活化、炎症介质激活,以及miR126a-5p和miR155-5p、Caspase 1和Caspase 3表达增加,而Vit C对此有抑制作用。而Vit C是否是通过干预miRNA活性进而影响Caspase及相关物质的具体表达机制尚有待于进一步研究。

参考文献 (27)

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